Aplikace RT-PCR v reálném čase v Covid-19

Co je rt-PCR v reálném čase?

Přidání fluorescenčních genů do reakčního systému PCR, využití akumulace fluorescenčního signálu pro sledování celého procesu PCR v reálném čase a následné kvantifikace neznámé šablony standardní křivkou se nazývá kvantitativní technologie PCR fluorescence v reálném čase, známá také jako Q-PCR v reálném čase.

Princip amplifikace PCR je stejný jako u běžného PCR nástroje, s tím rozdílem, že primery přidané během amplifikace PCR jsou označeny izotopy, fluoresceinem atd., a primery a fluorescenční sondy se používají k tomu, aby se současně specificky navázaly na šablonu pro zesílení.

Zesílené výsledky jsou shromažďovány a přenášeny do počítačového analytického a zpracovatelského systému prostřednictvím inkasního signálu fluorescenčního signálu v reálném čase, aby se získal kvantitativní výstup výsledků v reálném čase.

RT-PCR v reálném čase je jednou z nejpoužívanějších laboratorních metod pro detekci viru COVID-19. Zatímco mnoho zemí používá v reálném čase RT-PCR pro diagnostiku jiných nemocí, jako je virus Ebola a virus Zika, mnoho z nich potřebuje podporu při přizpůsobení této metody viru COVID-19, stejně jako při zvyšování jejich národních testovacích kapacit.

Jak funguje RT-PCR v reálném čase s virem COVID-19?

Vzorek se odebere z částí těla, kde se virus COVID-19 shromažďuje, jako je nos nebo hrdlo osoby. Vzorek se ošetří několika chemickými roztoky, které odstraňují látky, jako jsou bílkoviny a tuky, a extrahují pouze RNA přítomnou ve vzorku. Tato extrahovaná RNA je směsí vlastního genetického materiálu a, pokud je přítomna, RNA viru.

RNA je zpětně přepsána na DNA pomocí specifického enzymu. Vědci pak přidávají další krátké fragmenty DNA, které doplňují konkrétní části přepisované virové DNA. Pokud je virus přítomen ve vzorku, tyto fragmenty se připojují k cílovým úsekům virové DNA. Některé z přidaných genetických fragmentů se používají pro budování vláken DNA během zesílení, zatímco ostatní se používají k budování DNA a přidávání štítků markerů do pramenů, které se pak používají k detekci viru.

Směs se pak umístí do stroje RT-PCR. Stroj prochází teplotami, které ohřejí a ochlazují směs, aby vyvolal specifické chemické reakce, které vytvářejí nové, identické kopie cílových částí virové DNA. Cyklus se opakuje znovu a znovu, aby pokračoval v kopírování cílových částí virové DNA. Každý cyklus zdvojnásobuje předchozí číslo: dvě kopie se čtyři, čtyři kopie se osm, a tak dále. Standardní nastavení RT-PCR v reálném čase obvykle prochází 35 cykly, což znamená, že do konce procesu se z každého vlákna viru přítomného ve vzorku vytvoří přibližně 35 miliard nových kopií částí virové DNA.

Jak jsou postaveny nové kopie částí virové DNA, značkovací štítky se připojují k vláknům DNA a poté uvolňují fluorescenční barvivo, které se měří počítačem stroje a prezentováno v reálném čase na obrazovce. Počítač sleduje množství fluorescence ve vzorku po každém cyklu. Když je určitá úroveň fluorescence překonána, potvrzuje to, že virus je přítomen. Vědci také sledovat, kolik cyklů je zapotřebí k dosažení této úrovně s cílem odhadnout závažnost infekce: čím méně cyklů, tím závažnější je virová infekce.

Proč používat RT-PCR v reálném čase?

Technika RT-PCR v reálném čase je vysoce citlivá a specifická a může poskytnout spolehlivou diagnózu za pouhých tři hodiny, ačkoli laboratoře trvá v průměru šest až osm hodin. Ve srovnání s jinými dostupnými metodami izolace viru je RT-PCR v reálném čase výrazně rychlejší a má nižší potenciál kontaminace nebo chyb, protože celý proces může být prováděn v uzavřené zkumavce. Je i nadále nejpřesnější dostupnou metodou pro detekci viru COVID-19.

Rt-PCR v reálném čase však nelze použít k detekci minulých infekcí, což je důležité pro pochopení vývoje a šíření viru, protože viry jsou přítomny v těle pouze po určitou dobu. Jiné metody jsou nezbytné pro detekci, sledování a studium minulých infekcí, zejména těch, které se mohly vyvinout a šířit bez příznaků.